Separarea și Purificarea Proteinelor

Izolarea unei anumite proteine in stare pura dintr-o celula,tesut sau solutie ,este o problema dificila ,atat datorita labilitatii termice si chimice a acesteia,cat si datorita dilutiei mari si a compozitiei complexe a mediului din care trebuie izolata. . Proteinele pot fi separate si purificate pe baza solubilitatii, incarcaturii electrice, marimii sau capacitatii de legare a altor compusi. De obicei, amestecurile de proteine sunt supuse unor serii de separari, fiecare bazata pe o proprietate diferita. Separarea cromatografica utilizata in mod curent in clinica este electroforeza. In domeniul cercetarii se pot folosi insa tehnici mai variate: cromatografia de schimb ionic, de gel-filtrare, de afinitate, izoelectrofocusarea si electroforeza bidimensionala

Metodele de separare a proteinelor din solutie sunt clasificate in functie de principiul pe care se bazeaza:

-masa moleculara

-solubilitatea

-incarcarea electrica

-adsorbtia

-afinitatea pentru alte molecule

Procedeele de separare in functie de masa moleculara se bazeaza pe structura voluminoasa a moleculei proteinelor si constau in:dializa si ultrafiltrare,centrifugare in gradient de densitate(zonala),cromatografia de excludere moleculara.

Metodele bazate pe diferenta de solubilitate constau in modificarea solubilitatii moleculelor proteice in solutie ca rezultat al modificarii pH-ului,tariei ionice,proprietatilor dielectrice ale solventului,temperatura.Aceste metode sunt:precipitarea izoelecrica,salifierea,fractionarea cu solventi,efectul temperaturii.

Utilizarea incarcarii electrice este posibila datorita diferentelor intre incarcarea electrica a proteinelor ,ca rezultat al structurii deosebite a acestora.Deoarece proteinele contn secvente diferite de aminoacizi,vor avea caracteristici acido-bazice distincte.Aceste caracteristici sunt implicate in doua metode aplicate pe scara larga la separarea si analiza amestecurilor de proteine:electroforeza si cromatografia de schimb ionic.

Proteinele pot fi adsorbite si eluate selectiv de pe materiale inerte,fin divizate,care ofera o suprafata foarte mare comparativ cu dimensiunea particulelor.Aceste materiale inerte pot fi substante nepolare(carbune)sau polare(silicagel,gel de aluminiu).Cel mai utilizat material este fosfatul de calciu cristalin(hidroxiapatita).

Cromatografia de afinitate conduce la obtinerea unei puritati avansate a proteinelor separate din amestecuri complexe si are la baza capacitatea specifica a unor enzime de a lega necovalent o alta molecula denumita ligand(coenzima).Liganzii sunt atrasi la randul lor ,prin molecule covalente de o grupare functionala a unei particule solide poroase(agaroza).

Practic nu exista procedeu,sau grup de procedee ,prin care san nu poata fi izolata orice proteina.Prin alegerea corecta a etapelor de separare se poate atinge un grad inalt de puritate ,cu randamente ridicate.

Voi prezenta cateva dintre metodele folosite pentru separarea si precipitarea proteinelor.

1)Separarea si purificarea proteinelor prin precipitare cu saruri

Solubilitate proteinelor depinde,in principal, de concentratia sarurilor dintr-o solute,de constanta dielectrica a solventului si de valoarea pH-ului solutiei.La concentratii reduse,sarurile stabilizeaza diferitele grupari ionizate ale moleculei proteice,marind solubilitatea acesteia in apa(salting-in).Cu cresterea concentratiei sarurilor,se atinge un maxim al solubilitatii proteinelor,specific fiecarui tip de proteina,dupa care solubilitatea incepe sa scada,proteina precipitand in final(salting-out)Aceste fenomene stau la baza unor metode de separare si purificare a proteinelor.

Numeroase saruri pot fi utilizate in acest scop.Dintre acestea ,(NH4)2SO4 este cel mai folosit,datorita solubilitatii ridicate in apa si a pretului relativ scazut.

Pentru precipitarea proteinelor

1. Procese biotehnologice -proteine si enzime(lucrari practice)-Dan Cascaval;Anca Galaction

2. http://www.ddsdiagnostic.ro/lit.html

3. http://ph.academicdirect.org/MTFS2005.pdf