Metode de determinare a aminoacizilor prezenți în serul fiziologic

Aminoacizii sunt unităţile constituente ale proteinelor şi cuprind în molecula lor două grupări funcţionale: carboxil şi amino.Există 20 de aminoacizi proteinogeni specificaţi prin codul genetic, prezenţi în toate organismele vii.

Aminoacizii naturali au formula generală:

R-CH-COOH

NH2

în care gruparea aminică se află la carbonul  faţă de carboxil.Excepţie face prolina al cărui azot,deşi tot în poziţia  faţă de carboxil, face parte dintr-un inel pirolidinic, fiind o grupă aminică secundară.

Aminoacizii esenţiali

Cei 20 de aminoacizi naturali constituie alfabetul proteinelor.Distribuţia lor calitativă şi cantitativă într-o proteină determină caracteristicile chimice,valoarea ei nutritivă şi funcţiileei metabolice în organism.Dintre cei 20 de aminoacizi uzuali,organismul uman şi al vertebratelor superioare poate sintetiza un număr limitat,restul trebuie să fie furnizaţi zilnic prin hrană şi se numesc aminoacizi esenţiali !9!.Cei mai mulţi autori, consideră drept aminoacizi esenţiali următorii:valina,fenilalanina,metionina,lisina,triptofanul; alţii, includ şi leucina,izoleucina ,treonina şi histidina.

Caracteristici generale :

Aminoacizii îndeplinesc mai multe roluri biologice,fiind în acelaşi timp:

• ioni dipolari cu un moment de dipol mare, care determină o creştere considerabilă a mediului în care se dizolvă;

• electroliţi amfoteri solubili în apă, cu capacitatea de a acţiona ca substanţe tampon în diferite domenii de pH;

• sunt optic activi, datorită faptului că posedă unul sau mai mulţi atomi de carbon asimetrici, cu excepţia glicinei;

• sunt compuşi cu grupe reactive capabile să participe la reacţii chimice având ca rezultat o mare gamă de produse sintetice;

• sunt liganzi ai multor metale;

• sunt participanţi în reacţii metabolice cruciale, de care depinde viaţa şi sunt substanţe in vitro pentru o gamă mare de enzime;

• sunt constituenţi esenţiali ai moleculelor proteice ale căror caractere specifice,biologice şi

chimice sunt determinate în mare parte de numărul, distribuţia şi interrelaţiile aminoacizilor din care se compun.

Ei prezintă unitate şi diversitate în acelaşi timp:unitate, deoarece sunt -aminoacizi cu toate consecinţele fizice care decurg din aceasta şi pentru că cei care sunt componenţi uzuali ai proteinelor au aceeaşi configuraţie optică a atomului de carbon din poziţia , şi diversitate, deoarece fiecare din ei posedă o catenă diferită, care-i conferă proprietăţi unice, deosebindu-l fizic,chimic şi biologic de ceilalţi.

Intre metodele de determinare a aminoacizilor serici pe primul loc se situeaza cele cromatografice, electroforeza capilara (CE) cu detectie fluorescenta. Aceasta este dezvoltata ca o simpla metoda de determinare cantitativa a tirozinei, argininei, acidului glutamic din serul fiziologic. Au fost investigate conditiile de separare si derivatizre cu izotiocianatii fluorescenti. Ecuatiile de regresie au relevat o relatie liniara (coeficienti de corelare: 0.9927 – 0.9998) intre varful suprafetei si concentratia fiecarui analit. Au fost atinse limite de detectie de 10-10 M pentru aminoacizii detectati, iar nivelul acestora in serul fiziologic putand fi usor determinati cu o recuoerare de 93.5 – 106.5%.

Electroforeza capilara a capatat o atentie deosebita pentru separarea unor varietati de compusi , iar in zilele noastre este considerata o tehnica importanta complementara tehnicilor de separare cromatografica. Cu toate acestea, limita de detectare a concentratiei in cazul electroforezei complementare cu un detector UV este restransa datorita unor probe injectate si o lungime de unda scurta existenta doar pentru detectia “on-column”. Prin urmare, electroforeza capilara cu detectie fluorescenta reprezinta un interes particular atata timp cat pot fi atinse limite de detectie joase.

Aminoacizii care actioneaza ca neurotransmitatori sunt compusi biologici importanti care au de asemenea functii metabolice in sistemul central nervos. Schimbarile ce au loc la nivelul anumitor aminoacizi neurotransmitatori sunt cunoscute ca fiind asociate cu boli neuro-degenerative: boala Alzheimer sau Huntington. Asadar, masura nivelului de aminoacizi neurotransmitatori in fluidul corpului este semnificant. Este cunoscut faptul ca arginina, tirozina, acidul glutamic reprezinta 3 aminoacizi neurotransmitatori importanti ce sunt larg distribuiti in serul uman. In prezent s-au dezvoltat cateva metode de electroforeza capilara cu detectie fluorescenta pentru a determina aminoacizii din diferite probe biologice, cu toate acestea, nu s-a vorbit nimic despre determinarea cantitativa a argininei, tirozinei si a acidului glutamic in serul sanguin.

In figura de mai jos este reprezentata forma initiala a montajului, inainte de alimentarea cu tensiune, cand substantele sunt amestecate. Cand sistemul este alimentat cu tensiune electrica, componentele se separa in functie de gradientul lor de potential.

Electroforeza capilara (EC) este folosita pentru separarea speciilor ionice datorita incarcaturii lor electrice si a fortelor de atractie si respingere. Se deosebeste de cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC) doar prin faptul ca separarea pe componenti se face sub inalta tensiune electrica pe cand la HPLC se face cu o pompa de inalta presiune.

Exista si combinatii intre electroforeza capilara si HPLC ( ce nu se poate detecta cu HPLC intra in sistemul de detectare al electroforezei capilare).