Metoda cromatografică de determinare a nivelelor de homocisteină în lichidele biologice

Extras din referat Cum descarc?

Serul/plasma este o matrice biologica complexa ce contine pe langa homocisteina o serie de compusi inruditi cum ar fi cisteina, cistein-glicina, glutationul, toti, compusi cu caracter hidrosolubil.
Homocisteina este prezenta in ser/plasma legata de proteine, in proportie de 80%, sub forma de dimeri (cu compusi continand grupari tiol, prin intermediul puntilor disulfidice ) ~30 % si in forma libera in proportie extrem de mica de ~1%.
Datorita caracterului hidrosolubil homocisteina se separa usor prin electroforeza capilara. Metoda este simpla, insa necesita aparatura foarte costisitoare. Din acest motiv majoritatea metodelor de determinare utilizeaza metodele cromatografice, HPLC cu diferite sisteme de detectie.
Pentru ca este prezenta in cantitati foarte mici in sange/plasma/ser, semnalul cromatografic este slab de aceea pentru a putea fi determinata cromatografic, homocisteina trebuie mai intai derivatizata.
In plus, indiferent de metoda de detectie a homocisteinei, in prealabil, este necesara si o etapa ce converteste diferitele forme ale acesteia (forma legata de proteine sau formele dimere) in una singura si anume homocisteina redusa Hcys-SH.
Pentru aceasta este necesara tratarea matricei biologice cu un agent reductor care rupe puntile disulfidice.
In concluzie determinarea homocisteinei presupune parcurgerea obligatorie a urmatoarelor etape :
- a. eliberarea gruparilor SH prin ruperea puntilor disulfidice, in urma reactiei de reducere cu formarea homocisteinei reduse Hcys-SH.
- b. derivatizarea homocisteinei libere la gruparile SH, cu diferiti agenti de derivatizare.
a. Eliberarea gruparilor SH prin ruperea puntilor disulfidice, in urma reactiei de reducere cu formarea homocisteinei reduse Hcys-SH.
In scopul ruperii puntilor disulfidice s-au utilizat mai multi agenti reducatori: ditiotreitol, mercaptoetanol, Tris n-butil fosfina (TNBP).
A fost ales ca agent de reducere TNBT [1]. Desi timpul necesar reactiei de reducere este de circa 30 minute, reducerea este mult mai energica, reactia avand loc la temperatura 600C. Temperatura usor ridicata este favorabila denaturarii proteinelor care ulterior vor fi indepartate prin centrifugare. Se asigura astfel o purificare suplimentara a matricei biologice.
b. Derivatizarea homocisteinei libere la gruparile SH, cu diferiti agenti de derivatizare.
In scopul derivatizarii literatura indica un numar relativ mare de compusi.
Initial s-a utilizat ca agent de cuplare a legaturilor SH, ditio dinitro benzoic acid (DTNB) cu care s-a obtinut un timp de elutie bun 2,87 relativ apropiat de timpul de elutie al solventului. Acest timp de elutie mic, poate deveni un impediment ducand uneori la eluarea homocisteinei odata cu solventul.
Apoi s-a utilizat ca agent de derivatizare 2-cloro- 1-metilpiridinium tetrafluoroborat (CQMT). In cazul utilizarii CMQT elutia homocisteinei are loc la tR = 8,5 semnificativ distantat de timpul de elutie al solventului. In plus utilizand CMQT ca agent de derivatizare, reactia de derivatizare dureaza 5 minute comparativ cu 30 minute in cazul DTNB (metoda utilizata anterior).
Sistemul cromatografic
Pentru cromatografierea probelor a fost utilizat un cromatograf HPLC Hewlett- Packard, cu coloana cu faza inversa C18, 5 um, 125 x 4 mm.
Faza mobila a fost alcatuita din doua solutii:
A. acetonitril
B. amestec de acid acetic triclor 0,1 M, LiON 0,1 M la pH=1,65. Elutia a avut loc in gradient de concentratie astfel : - 4 minute 11% A si 89% B
- 8 minute 35% A si 65% B - 12 minute 11% A si 89% B
Debitul fazei mobile a fost de 1,2 ml/min.
Sistemul de detectie utilizat a fost un spectrofotometru UV-vis cu diode-array, la 312 nm. Identificarea picurilor s-a facut pe baza compararii timpilor de retentie si a spectrelor cu datele obtinute pentru homocisteina pura.


Fisiere in arhiva (1):

  • Metoda Cromatografica de Determinare a Nivelelor de Homocisteina in Lichidele Biologice.doc

Imagini din acest referat Cum descarc?

Promoție: 1+1 gratis

După plată vei primi prin email un cod de download pentru a descărca gratis oricare alt referat de pe site (vezi detalii).


Descarcă aceast referat cu doar 4 € (1+1 gratis)

Simplu și rapid în doar 2 pași: completezi adresa de email și plătești. După descărcarea primului referat vei primi prin email un cod promo pentru a descărca orice alt referat.

1. Numele, Prenumele si adresa de email:

ex. Andrei, Oana
ex. Popescu, Ionescu

Pe adresa de email specificată vei primi link-ul de descărcare și codul promo. Asigură-te că adresa este corectă și că poate primi e-mail-uri.

2. Alege modalitatea de plată preferată:


* La pretul afișat se adaugă 19% TVA.


Hopa sus!