Metoda cromatografică de determinare a nivelelor de homocisteină în lichidele biologice

Serul/plasma este o matrice biologică complexă ce conţine pe lângă homocisteină o serie de compuşi înrudiţi cum ar fi cisteina, cistein-glicina, glutationul, toţi, compuşi cu caracter hidrosolubil.

Homocisteina este prezentă în ser/plasma legată de proteine, în proportie de 80%, sub formă de dimeri (cu compuşi conţinând grupări tiol, prin intermediul punţilor disulfidice ) ~30 % şi in formă liberă în proporţie extrem de mică de ~1%.

Datorită caracterului hidrosolubil homocisteina se separă usor prin electroforeză capilară. Metoda este simplă, însă necesită aparatură foarte costisitoare. Din acest motiv majoritatea metodelor de determinare utilizează metodele cromatografice, HPLC cu diferite sisteme de detecţie.

Pentru că este prezentă în cantităţi foarte mici în sânge/plasmă/ser, semnalul cromatografic este slab de aceea pentru a putea fi determinata cromatografic, homocisteina trebuie mai întâi derivatizată.

În plus, indiferent de metoda de detecţie a homocisteinei, în prealabil, este necesară şi o etapă ce converteşte diferitele forme ale acesteia (forma legată de proteine sau formele dimere) în una singura şi anume homocisteina redusă Hcys-SH.

Pentru aceasta este necesară tratarea matricei biologice cu un agent reductor care rupe punţile disulfidice.

In concluzie determinarea homocisteinei presupune parcurgerea obligatorie a urmatoarelor etape :

- a. eliberarea grupărilor SH prin ruperea punţilor disulfidice, în urma reacţiei de reducere cu formarea homocisteinei reduse Hcys-SH.

- b. derivatizarea homocisteinei libere la gruparile SH, cu diferiti agenti de derivatizare.

a. Eliberarea grupărilor SH prin ruperea punţilor disulfidice, în urma reacţiei de reducere cu formarea homocisteinei reduse Hcys-SH.

În scopul ruperii punţilor disulfidice s-au utilizat mai mulţi agenti reducători: ditiotreitol, mercaptoetanol, Tris n-butil fosfina (TNBP).

A fost ales ca agent de reducere TNBT [1]. Deşi timpul necesar reacţiei de reducere este de circa 30 minute, reducerea este mult mai energică, reacţia având loc la temperatura 600C. Temperatura uşor ridicată este favorabilă denaturării proteinelor care ulterior vor fi îndepartate prin centrifugare. Se asigură astfel o purificare suplimentară a matricei biologice.

b. Derivatizarea homocisteinei libere la gruparile SH, cu diferiţi agenţi de derivatizare.

In scopul derivatizării literatura indică un număr relativ mare de compuşi.

Iniţial s-a utilizat ca agent de cuplare a legăturilor SH, ditio dinitro benzoic acid (DTNB) cu care s-a obtinut un timp de eluţie bun 2,87 relativ apropiat de timpul de eluţie al solventului. Acest timp de eluţie mic, poate deveni un impediment ducând uneori la eluarea homocisteinei odata cu solventul.

Apoi s-a utilizat ca agent de derivatizare 2-cloro- 1-metilpiridinium tetrafluoroborat (CQMT). În cazul utilizarii CMQT eluţia homocisteinei are loc la tR = 8,5 semnificativ distanţat de timpul de eluţie al solventului. În plus utilizând CMQT ca agent de derivatizare, reacţia de derivatizare dureaza 5 minute comparativ cu 30 minute în cazul DTNB (metoda utilizata anterior).

Sistemul cromatografic

Pentru cromatografierea probelor a fost utilizat un cromatograf HPLC Hewlett- Packard, cu coloana cu faza inversa C18, 5 um, 125 x 4 mm.

Faza mobilă a fost alcatuită din două soluţii:

A. acetonitril

B. amestec de acid acetic triclor 0,1 M, LiON 0,1 M la pH=1,65. Eluţia a avut loc în gradient de concentraţie astfel : - 4 minute 11% A şi 89% B

- 8 minute 35% A şi 65% B - 12 minute 11% A şi 89% B

Debitul fazei mobile a fost de 1,2 ml/min.

Sistemul de detecţie utilizat a fost un spectrofotometru UV-vis cu diode-array, la 312 nm. Identificarea picurilor s-a făcut pe baza comparării timpilor de retenţie şi a spectrelor cu datele obtinute pentru homocisteina pură.