Studii biologice, biochimice și tehnologice privind drojdiile consumatoare de etanol

Drojdii consumatoare de etanol

Obţinerea biomasei pe diferite substraturi cu ajutorul microorganismelor a fost şi este în continuare un capitol important al industriei de biosinteză. Dacă la început această masă celulară, cunoscută sub denumirea de „proteine monocelulare” (Single Cell Protein) a fost utilizată în special ca aditiv furajer pentru îmbogăţirea hranei animalelor în proteine şi vitamine, astăzi destinaţiile ei s-au diversificat. Biomasa microbiană este utilizată ca :

- biocatalizator pentru obţinerea unor produşi optic activi utilizaţi în industria de medicamente;

- produse de tip ``aliment-medicament`` pentru uz uman, în special ca normalizator biologic (probiotic) al florei intestinale saprofite ;

- aditivi în hrana umană.

- drojdiile sunt utilizate în alimentaţia umană de mii de ani, fiind stâns legate de istoria civilizaţiei umane (pâine, vin), atfel încât nu mai trebuie să depăşească bariera psihologică ce apare la introducerea în alimentaţia/terapia umană a unui nou produs biotehnologic;

- datorită marii adaptabilităţi pot utiliza diferite surse de carbon cu randamente de transformare suficient de ridicate pentru a le face atractive ecconomic;

- datorită dimensiunilor mai mari pot fi separate mai uşor din mediul biologic în care se dezvoltă, fără a necesita aparatură scumpă.

În literatura de specialitate sunt citate numeroase specii de drojdii utilizate (utilizabile) pentru obţinerea de biomasă pe etanol, cele mai multe aparţinând genurilor Saccharomyces şi Candida (Candida acidothermophilum, C. ethanothermophilum, C. utilis), Hansenula (Hansenula anomala)

Laskin citează drojdii din genurile Candida, Debaromyces, Endomycopsis, Hansenula, Mycoderma, Pichia, Rhodotorula şi Saccharomyces pentru care compania Exxon-Nestle a inţiat proiecte de dezvoltare a unor procese de obtinere a biomasei pe substrat de etanol.

Hitzman menţionează tulpini de drojdii din genurile Candida, Pichia, Hansenula şi Torulopsis testate de compania Provesta-Philipps în cursul dezvoltării unor procese de obţinere a biomasei de drojdie la densităţi celulare mari. Principalele criterii de selecţie a tulpinilor pentru utilizare industrială s-au referit la obţinerea unor randamente de substrat mari şi constante, stabilitatea tulpinii pe parcursul unor bioprocese cu durată mare în timpul cărora pot apărea condiţii de cultivare adverse determinate de disfuncţionalităţi ale utilajelor, apariţia contaminării, etc. Deoarece biomasa obţinută de firma Provesta-Philipps era destinată utilizării în alimentaţie un conţinut proteic în jur de 60% reprezenta un parametru esenţial în alegerea tulpinii producătoare.

Aspecte biochimice ale creşterii drojdiilor pe etanol

Drojdia S.cerevisiae este unul dintre cele mai simple organisme eucariote, cu o mărime a genomului doar de trei ori mai mare decât al bacteriei E.coli. Metabolismul acestei drojdii este extrem de adaptabil, ea fiind capabilă să crească pe o varietate foarte mare de substraturi, în condiţii favorabile putând creşte în prezenţa unor concentraţii mari de etanol

Figura 1 ilustrează calea metabolică de utilizare a etanolului de către drojdii, prezentând importanţa ciclului glioxilatului pentru metabolizarea etanolului.

În prima etapă, etanolul este oxidat la acetaldehida. Shachar-Nishri şi Freeman prezintă două căi metabolice prin care poate avea loc această reacţie:

1. Reducerea etanolului la acetaldehidă cu ajutorul alcool - dehidrogenazei, conform reacţiei:

aceasta reacţie este specifică drojdiilor S.cerevisiaei, Candida utilis.

2.Oxidarea etanolului la acetaldehidă cu ajutorul alcool-oxidazei :

reacţie caracteristică speciilor Candida boidinii şi Pichia pastoris .

Figura 1. Reactiile biochimice ale ciclului glioxilatului

Acetaldehida formată este oxidată în continuare la acetat. Ca rezultat al acestor oxidări, se produc 2 molecule de NADH pentru fiecare moleculă de etanol transformată în acetat. Acetatul produs se poate acumula în mediul extracelular sau poate fi transformat în acetil-CoA, în funcţie de concentraţia de etanol şi activitatea metabolică a microorganismului. Acetil-CoA formată intră în ciclul TCA, transformandu-se în malat.

Indiferent de sursa de carbon folosită, drojdiile elimină în mediu oxalilacetat şi alţi intermediari metabolici. În cazul microorganismelor ce cresc pe substrat C2 (etanol, acetat) alimentarea cu precursori ai acidului oxalilacetic este realizată cu ajutorul enzimelor izocitrat liaza şi malat sintetaza. Acţiunea acestor două enzime cheie permite compusului C2 (acetil-CoA) să intre într-un al doilea punct în ciclu, având drept rezultat sinteza intermediarilor din ciclul TCA (acizilor tricorboxilici). S-a demonstrat că această cale este controlată de concentraţia intracelulară de fosfoenolpiruvat, care inhibă activitatea izocitrat liazei.

Atunci când singura sursă de carbon disponibilă este un compus C2 (acetat sau etanol) este necesară utilizarea ciclului glioxilatului, acesta fiind necesar şi suficient pentru reaprovizionarea cu intermediari în timpul creşterii pe etanol. Acest ciclu este supus controlului exercitat asupra sintezei şi activităţii izocitratliazei. Deşi mecanismele de reglare nu sunt perfect cunoscute, s-a emis ipoteza conform căreia atât controlul genetic cât si cel al activitătii enzimatice sunt realizate prin intermediul concentraţiei aceluiaşi compus: fosfoenolpiruvatul.

Atunci când sursa de carbon utilizată este un zahar, intermediarii ciclului TCA sunt menţinuţi la un nivel suficient astfel încât nu mai este necesară sinteza izocitrat liazei. În cazul unui aport insuficient de fosfoenolpiruvat, va fi derepresată sinteza izocitratliazei, creîndu-se astfel posibilitatea utilizării acetatului (ca produs de metabolism al etanolului)

Un alt mecanism al căii metabolice de utilizare a etanolului de către drojdii este propus de Humphrey, completând teoria anterioară.

O parte din acetil-CoA intră în ciclul TCA şi evoluează direct la malat. În acest caz, cea mai mare parte din NADH citoplasmatic este implicat în oxidarea etanolului astfel încât malatul este transformat mai degrabă în piruvat pentru sinteza componenţilor celulari şi creşterea microorganismului, decât în oxalilacetat care necesită NAD. Pe măsură ce concentraţia de etanol scade şi acetatul extracelular este adus înapoi în celulă de o variaţie în echilibrul acetatului, mai mult NAD devine disponibil pentru transformarea malatului în oxalilacetat. Astfel o proporţie crescută de acetil CoA trece prin întreg ciclul TCA. Deci la concentraţii scăzute de etanol şi ridicate de acetat, o mai mare parte a substratului este utilizată pentru menţinere, decât pentru creşterea celulară.

De aceea este posibil să se observe o creştere a coeficientului respirator atâta timp cât un procent mare din acetil CoA trece prin tot ciclul, deoarece se produce mai mult CO2 în timp ce consumul de oxigen ramâne acelaşi. În plus, nivelele de NADH scad o dată cu declinul conversiei etanolului si creşterea consumului de acetat extracelular.

Utilizarea etanolului în celulă este prezentată. Etanolul este oxidat la acetaldehidă de către alcool dehidrogenază (izoenzima ADH II).

Obţinerea etanolului ca produs final al glicolizei şi utilizarea acestuia ca sursă de carbon şi energie pentru creştere, depind de activitatea acestei enzime. Izoenzimele ADH din S.cerevisiae reprezintă o familie de enzime NAD dependente, diversificate funcţional. Ele aparţin grupului de enzime Zn-dependente prezentând identitate secvenţială.

ADH I, izoenzima fermentativă clasică, localizată în citosol, este responsabilă pentru ultima etapă din ciclul glicolitic la drojdii (reducerea acetaldehidei la etanol)

ADH II, izoenzima oxidativă este represată în condiţii fermentative şi derepresată în absenţa unaui zahar ce poate fi fermentat, cum este glucoza. În celula drojdiilor, ADH II oxidează etanolul la acetaldehidă, intermediar în gluconeogeneză. Enzima este extramitocondrială. ADH 2, gena structurală pentru ADH II este reglată la nivel transcripţional de represia catabolică prin intermediul unui efector pozitiv specific, codificat de gena ADR 1.

Izoenzima ADH III a fost descoperită de Lutsdorf şi Megnet. Este localizată în mitocondrii, fiind prezentă la drojdii crescute pe glucoză sau etanol. Funcţia metabolică a acestei enzime nu este clar cunoscută, dar există indicaţii că nu funcţionează fermentativ: tulpini ce conţin doar ADH III nu pot supravieţui ca tulpini „petit” care obţin energia doar prin fermentaţie. Este posibil ca ADH III să fie implicată în metabolismul respirator, ţînând seama şi de localizarea ei mitocondrială.