Genul Aspergillus

Genul Aspergillus prezinta un deosebit interes, pe de o parte datorita aplicatiilor biotehnologice precum si datorita faptului ca unii reprezentanti sunt cunoscuti ca patogeni.

In perspectiva ameliorarii tulpinilor de interes biotehnologic si a unei mai precise orientari a compusilor antifungici cu aplicatii medicale se urmareste elaborarea unor metode care sa permita o cat mai rapida si precisa identificare a tulpinilor fungice.

Obiectivul general al proiectului este confirmarea/ infirmarea, pe baza unor tehnici moleculare, a incadrarii taxonomice a unor tulpini de fungi presupuse a apartine genului Aspergillus, presupunere bazata in exclusivitate pe metode clasice.

Pe langa metodele clasice, care intampina, adesea, dificultati, in discriminarea intre diversele tulpini microfungice, la ora actuala sunt disponibile metode moleculare care permit incadrarea acurata a izolatelor naturale.

In intentia echipei noastre a stat aplicarea de astfel de metode moleculare pe tulpini fungice cu potential biotehnologic izolate in tara, tulpini a caror incadrarare in genul Aspergillus s-a facut, pana in prezent, exclusiv pe baza unor tehnici clasice de taxonomie microbiana.

Aceasta a presupus, ca o preconditie, obtinerea de extracte de ADN cromozomal de integritate si puritate adecvata.

S-a urmarit atingerea acestui obiectiv, cu ajutorul metodei Vogel (modificata de Anderson & Prebble) de extractie a ADN cromozomal din fungi, metoda care aplicata in prealabil in laboratorul nostru, pe o tulpina standard de A. niger (respectiv A. niger ATCC 46404), cu rezultate remarcabile.

Intr-o prima etapa s-a realizat stabilirea parametrilor de lucru, respectiv adaptarea tehnicii de extractie a ADN pentru izolatele naturale luate in studiu.

Materiale si metode

Tulpini fungice utilizate

Aspergillus niger PC41

Aspergilus niger ATCC 4640

Metode

Metoda Anderson & Prebble (Vogel) de extractie a ADN cromozomal din fungi

Metoda se bazeaza pe eliberarea continutului celular prin soc termic, urmata de izolarea si purificarea acizilor nucleici.

Tulpinile mentinute pe mediu Czapek agarizat se trec pe MEA agarizat si, dupa un interval de 48 de ore, necesar dezvoltarii au fost cultivate pe mediu MEA lichid, sub agitare, la o temperatura constanta de 280C. Biomasa crioconservata se spala cu solutie de sulfat de magneziu 0,6 M, filtrata sub vid, pana la deshidratare avansata si depozitata la -700C. Masa celulara pastrata la -700C se mojareaza, obtinandu-se o pulbere fina, care este imediat tratata cu tampon de extractie incalzit la 650C.

Purificarea acizilor nucleici se realizeaza prin deproteinizare cu CIA si solutie salina (acetat de amoniu 7,5 M). Acizii nucleici sunt precipitati cu izopropanol si resuspendati in tampon TE. Extractul se poate depozita la -200C, in vederea utilizarii ulterioare.

Verificarea electroforetica a integritatii si puritatii ADN

Prin electroforeza in gel de agaroza in placa orizontala in sistem submers s-a verificat gradul de fragmentare a moleculelor deADN si gradul de contaminare cu ARN.

S-a folosit agaroza SIGMA dizolvata in TBE 1X, intr-o concentratie de 0,8%. In tamponul TBE (Tris 0,089M, acid boric 0,089M, EDTA 0,002M, pH=8,5), s-a adaugat bromura de etidium intr-o concentratie finala de 1mg/ml

Verificarea spectrofotometrica a puritatii si integritatii extractului de ADN

Analiza spectrofotometrica a gradului de puritate si integritate a moleculelor de ADN s-a realizat cu ajutorul unui spectrofotometru UV-VIS ULTROSPEC 3000.

In functie de valorile A260 si A280 se poate stabili gradul de contaminare proteica, astfel: raportul A260/A280 optim este de 1.8-2.0. Daca acest raport este mai mic de 1.7, atunci contaminarea proteica a extractului este semnificativa.