Genul Aspergillus

Extras din referat Cum descarc?

Genul Aspergillus prezinta un deosebit interes, pe de o parte datorita aplicatiilor biotehnologice precum si datorita faptului ca unii reprezentanti sunt cunoscuti ca patogeni.  
In perspectiva ameliorarii tulpinilor de interes biotehnologic si a unei mai precise orientari a compusilor antifungici cu aplicatii medicale se urmareste elaborarea unor metode care sa permita o cat mai rapida si precisa identificare a tulpinilor fungice.
Obiectivul general al proiectului este confirmarea/ infirmarea, pe baza unor tehnici moleculare, a incadrarii taxonomice a unor tulpini de fungi presupuse a apartine genului Aspergillus, presupunere bazata in exclusivitate pe metode clasice.
Pe langa metodele clasice, care intampina, adesea, dificultati, in discriminarea intre diversele tulpini microfungice, la ora actuala sunt disponibile metode moleculare care permit incadrarea acurata a izolatelor naturale. 
In intentia echipei noastre a stat aplicarea de astfel de metode moleculare pe tulpini fungice cu potential biotehnologic izolate in tara, tulpini a caror incadrarare in genul Aspergillus s-a facut, pana in prezent, exclusiv pe baza unor tehnici clasice de taxonomie microbiana.
Aceasta a presupus, ca o preconditie, obtinerea de extracte de ADN cromozomal de integritate si puritate adecvata. 
S-a urmarit atingerea acestui obiectiv, cu ajutorul metodei Vogel (modificata de Anderson & Prebble) de extractie a ADN cromozomal din fungi, metoda care aplicata in prealabil in laboratorul nostru, pe o tulpina standard de A. niger (respectiv A. niger ATCC 46404),  cu rezultate remarcabile.
Intr-o prima etapa s-a realizat stabilirea parametrilor de lucru, respectiv adaptarea tehnicii de extractie a ADN pentru izolatele naturale luate in studiu.  
Materiale si metode
Tulpini fungice utilizate 
Aspergillus niger PC41
Aspergilus niger ATCC 4640 
Metode
Metoda Anderson & Prebble (Vogel) de extractie a ADN cromozomal din fungi
Metoda se bazeaza pe eliberarea continutului celular prin soc termic, urmata de izolarea si purificarea acizilor nucleici.
Tulpinile mentinute pe mediu Czapek agarizat se trec pe MEA agarizat si, dupa un interval de 48 de ore, necesar dezvoltarii au fost cultivate pe mediu MEA lichid, sub agitare, la o temperatura constanta de 280C. Biomasa crioconservata se spala cu solutie de sulfat de magneziu 0,6 M, filtrata sub vid, pana la deshidratare avansata si depozitata la -700C. Masa celulara pastrata la -700C se mojareaza, obtinandu-se o pulbere fina, care este imediat tratata cu tampon de extractie incalzit la 650C. 
Purificarea acizilor nucleici se realizeaza prin deproteinizare cu CIA si solutie salina (acetat de amoniu 7,5 M). Acizii nucleici sunt precipitati cu izopropanol si resuspendati in tampon TE. Extractul se poate depozita la -200C, in vederea utilizarii ulterioare.
Verificarea electroforetica a integritatii si puritatii ADN
Prin electroforeza in gel de agaroza in placa orizontala in sistem submers s-a verificat gradul de fragmentare a moleculelor deADN si gradul de contaminare cu ARN. 
S-a folosit agaroza SIGMA dizolvata in TBE 1X, intr-o concentratie de 0,8%. In tamponul TBE (Tris 0,089M, acid boric 0,089M, EDTA 0,002M, pH=8,5), s-a adaugat bromura de etidium intr-o concentratie finala de 1mg/ml 
Verificarea spectrofotometrica a puritatii si integritatii extractului de ADN
Analiza spectrofotometrica a gradului de puritate si integritate a moleculelor de ADN s-a realizat cu ajutorul unui spectrofotometru UV-VIS ULTROSPEC 3000.
In functie de valorile A260 si A280 se poate stabili gradul de contaminare proteica, astfel: raportul A260/A280 optim este de 1.8-2.0. Daca acest raport este mai mic de 1.7, atunci contaminarea proteica a extractului este semnificativa.


Fisiere in arhiva (1):

  • Genul Aspergillus.doc

Imagini din acest proiect Cum descarc?

Promoție: 1+1 gratis

După plată vei primi prin email un cod de download pentru a descărca gratis oricare alt referat de pe site.Vezi detalii.


Descarcă aceast referat cu doar 4 € (1+1 gratis)

Simplu și rapid în doar 2 pași: completezi adresa de email și plătești. După descărcarea primului referat vei primi prin email un alt cod pentru a descărca orice alt referat.

1. Numele, Prenumele si adresa de email:

Pe adresa de email specificata vei primi link-ul de descarcare, nr. comenzii si factura (la plata cu cardul). Daca nu gasesti email-ul, verifica si directoarele spam, junk sau toate mesajele.

2. Alege modalitatea de plata preferata:


* Prețul este fără TVA.

Hopa sus!