Cuantificarea ADN

Prin reactia PCR sau in lant a polimeraze amplificam un locus (gena) sau un fragment de gena ,sau mai multe regiuni din ADN in miliarde de copii,in doar cateva ore pentru a studia polimorfismul de la loci diferiti ,in vederea intocmiri unei amprente de ADN,a stabiliri relatilor de rudenie intre indivizi.

Avem nevoie de probe de ADN care sa corespunda atat cantitativ cat si calitativ.

Pentru realizarea unei amplificari PCR de buna calitate ,cantitatea de matrita din reactie trebuie sa fie adecvata.

Cantitatea de ADN matrita adaugata intr -o reactie PCR depinde de complexitatea ADN utilizat.De exemplu pentru un ADN plasmidial de 4 kb,din care dorim sa amplificam doar un 1 kb prin reactia PCR ,matrita repreazinta 25% din totalul de ADN.Dar in cazul organismelor cu genoame complexe ,cum este cel uman , a carui marime este de 3,3?109pb, o matrita de 1 kb reprezinta doar 0,00003% din cantitatea de ADN intrata in reactie.

Prin urmare ,pentru obtinerea aceleiasi cantitati de produs PCR de pe o matrita de ADN de 1 kb in cazul genomului uman este necesara o cantitate de aproximativ de 1.000.000 ori mai mare decat in cazul ADN plasmidial bacterian.Reactiile PCR cu o cantitate foarte mica de matrita la start vor avea si o cantitate redusa de produs PCR,in timp ce in reactiile cu cantitate de ADN matrita in exces se vor produce si amplificari nespecifice.

Cresterea cantiatii de produs PCR de calitate precum si o scadere a produsilor nedoriti,obtinuti intro-o reactie PCR se poate realiza cu ajutorul unor substante care actioneaza prin diferite mecanisme ,intensificand procesul de amplificare specifica.De obicei de aceasta imbunatatire a performantelor reactiei PCR beneficiaza primerii specifici si matrita.

Betaina,dimetilsulfoxidul(DMSO) si formamida sunt utilizati in cazul amplificarilor de regiuni bogate in CG cand se pot forma structuri secundare.Betaina reduce cantitatea de energie necesara pentru ruperea legaturilor duble dintre moleculele matritei de ADN dublu catenare,DMSO si formamida reduc posibilitatea refacerii legaturilor duble si ajuta la realizarea aceluiasi efect ca si betaina.

Alte substante care inbunatatesc reactia PCR sunt cele ce contin ioni de amoniu si care pot creste specificitatea reactiei in conditii suboptime.Dintre acestea cele mai utilizate sunt sulfatul de amoniu si clorura de tetrametilamoniu.

Inainte de efectuarea analizei propriu-zise, este necesara evaluarea pretabilitatii extractelor la analize bazate pe reactia PCR clasica, dar mai ales la cele bazate pe reactia real-time PCR. Criteriile esentiale in acest context sunt cantitatea de ADN recuperat si calitatea extractului si a ADN-ului (Cankar et al., 2006; Moens et al.,2005; Meyer, 1999).