Metode de analiza a proteinelor

Principiul metodei

In urma hidrolizei cazeinei in prezenta enzimelor proteolitice se elibereaza in mediul de reactie produsi de hidroliza (tirozina, triptofan) care se determina colorimetric cu reactivul Folin-Ciocalteu ca tirozina.

Reactivi

Solutia de cazeina 2%: se dizolva 2 g cazeina Hammerstein in 70 ml apa distilata adusa in prealabil la pH 10 cu NaOH. Dupa dizolvare se ajusteaza pH-ul la 8,0 cu HCl si se aduce la 100 ml cu apa distilata.

Solutie NaOH 0,5 M.

3. Solutie acid tricloracetic (TCA) 5% (greutate / greutate).

4. Reactiv Folin-Ciocalteu diluat cu apa distilata in raport de volum 1:2 imediat inainte de folosire.

5. Tampon fosfat 0,05 M, pH 8: se dizolva 36,57 mg NaH2PO4- H2O si 1,6959 g Na2HPO4- 12H2O in apa distilata si se aduce la balon cotat de 100 ml.

6. Solutie HCl 0,2 N.

7. Solutie L(-) - tirozina 1 mM: se dizolva 181,19 mg tirozina in apa distilata si se aduce la balon cotat de 1000 ml.

Aparatura

Spectrofotometru tip Hitachi 1100.

Curba de etalonare pentru tirozina

Se pipeteaza in 11 eprubete curate si uscate 0; 40; 80; 120; 160; 200; 240; 320; 360 si 400 ul solutie L(-) - tirozina. Se completeaza la 2,00 ml cu HCl 0,2 N. Se adauga cate 4 ml NaOH 0,5 N si sub agitare puternica 1,2 ml reactiv Folin-Ciocalteu. Se lasa la temperatura camerei 30 minute, apoi se citeste absorbanta la 578 nm fata de apa distilata. Se scade absorbanta martorului. Se construieste un grafic cu E578 pe ordonata si umoli L(-) - tirozina pe abscisa.

Tabel 8. Curba de etalonare pentru proteza cu L-Tyr

Nr. crt.L-Tyr

ul umoliHCl 0,2 N

mlE1E2EmE-Emartor

1.002,000,0130,0700,0410

2.400,041,960,0490,0630,0560,014

3.800,081,920,1050,1000,1020,061

4.1200,121,880,1970,1550,1760,134

5.1600,161,840,2200,2040,2120,170

6.2000,201,800,2660,2570,2610,220

7.2400,241,760,3110,3260,3180,277

8.2800,281,720,3390,3500,3440,303

9.3200,321,680,3900,4130,4010,360

10.3600,361,640,4450,4510,4480,406

Figura 31. Curba de etalonare pentru proteaze cu L-Tyr

Reactia enzimatica

Se lucreaza cu 2 probe si 2 martori in paralel.

Se termosteaza la 37oC in eprubete:

-2 ml solutie substrat (cazeina)

-0,8 ml tampon fosfat 0,05 M pH 8,0.

La timpul zero se adauga sub agitare 0,2 ml solutie enzimatica si se incubeaza exact 10 minute la 37oC. Reactia se stopeaza cu 4 ml solutie TCA. Martorul se realizeaza in aceleasi conditii, dar TCA se adauga inaintea cazeinei. Adaugarea TCA se face sub agitare puternica. Probele se lasa la temperatura camerei 30 minute, apoi se filtreaza pe hartie de filtru.

Reactia de culoare

Din filtrat se iau probe pentru reactia de culoare si anume se pipeteaza in ordine:

-1 ml filtrat

-1 ml HCl 0,2 N

-1 ml solutie NaOH 0,5 N

-1,2 ml reactiv Folin-Ciocalteu diluat 1:2

Dupa adaugarea fiecarui reactiv probele se agita. Se lasa sa stea 30 minute la temperatura camerei pentru perfectarea culorii, apoi se citeste extinctia la 578 nm fata de apa distilata. Din curba de etalonare se determina umoli tirozina corespunzator la extinctia masurata.

Calcul rezultatelor

Metoda Anson defineste o unitate enzimatica drept cantitatea de enzima care elibereaza in mediu, prin hidroliza hemoglobinei, 1 mM tirozina per minut la 37oC. In cazul nostru, pentru usurinta calculelor se va lua o valoare de lucru de 1000 ori mai mica, raportul facandu-se la 1 umol tirozina. Deoarece se foloseste drept substrat cazeina in locul hemoglobinei (mai ieftina si mai usor de preparat solutia), la produsele finale obtinute comparatia cu alte preparate enzimatice se poate face folosind ca substrat hemoglobina.

Activitatea enzimatica se calculeaza cu formula:

unde:

- 0,2 = volumul solutiei enzimatice luat la incubare, ml;

- l = volumul filtratului luat in lucru, ml;

- 7 = volumul total la incubare, ml;

- 10 = timpul de incubare, minute;

- g = concentratia solutiei enzimatice, mg/ml.

3.1.2. Metoda Lowry de determinare a proteinelor

Principiul metodei

Dozarea proteinelor (domeniu 25-500 ug) se bazeaza pe formarea unui complex cupric cand proteina reactioneaza cu un reactiv alcalin de cupru (reactia biuretului) si pe reducerea fosfomolibdatilor si fosfowolframatilor din reactivul Folin-Ciocalteu de catre compusii fenolici din proteina (in special tirozina).

Reactivi